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双孢蘑菇颜色基因分子标记的初步筛选

摘要 以4个白色和4个棕色双孢蘑菇(Agaricus bisporus)菌株,对其500个随机扩增多态性DNA (random amplified polymorphic DNA,RAPD)随机引物进行筛选,筛选出的S33、S438、S485 3个引物在棕色菌株组能扩增出4个特异条带(大小300~2000 bp),将特异片段回收,克隆
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时时彩平台哪个好 www.1otf.com.cn   摘要 以4个白色和4个棕色双孢蘑菇(Agaricus bisporus)菌株,对其500个随机扩增多态性DNA (random amplified polymorphic DNA,RAPD)随机引物进行筛选,筛选出的S33、S438、S485 3个引物在棕色菌株组能扩增出4个特异条带(大小300~2000 bp),将特异片段回收,克隆测序,将合成的4对特征序列扩增区域(sequence characterized amplified regions,SCAR)标记引物对48个菌株进行验证,结果表明:仅SCAR41200在24个棕色菌株的22个中能扩增出特异条带,而所有白色菌株中都没有此条带,表明该标记与棕色菌株的棕色基因相关。
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  关键词 双孢蘑菇; 子实体颜色基因; 随机扩增多态性DNA; 特征序列扩增区域
  双孢蘑菇(Agaricus bisporus)是世界人工栽培最广泛、产量最高、消费量最大的食用菌之一,具有重要的经济价值[1]。目前,中国双孢蘑菇主栽品种单一,当家品种As2796从育种至今已使用20年,面临退化问题,再加上产业持续健康发展需要,亟须选育适合不同用途的专用优良新菌株,但野生菌株中很大一部分为棕色[2],在利用其进行杂交选育的过程中如何对杂交后代进行颜色性状筛选是育种工作面临的重要问题。传统筛选手段需出菇,工作量巨大。近年来发展的DNA分子标记辅助育种技术是食用菌定向辅助育种的重要方向,特征序列扩增区域(sequence characterized amplified regions,SCAR)标记因方便、可靠,可快速检测大量个体等众多优点已成为目前分子标记在育种实践中直接应用的首选[3]。笔者采用随机扩增多态性DNA (random amplified polymorphic DNA,RAPD)开展双孢蘑菇颜色相关基因的分子标记研究,以期获得与颜色性状相关标记,并转化为能在杂交育种中直接利用的SCAR标记,这对缩短育种周期、提高育种效率及定向筛选具有重要意义。
  1 材料与方法
  1.1菌株
  本研究供试菌株均为福建省农业科学院食用菌研究所保藏。所有菌株子实体颜色的基因型都已经过农艺性状出菇确定。
  1.1.1RAPD引物筛选菌株
  棕色菌株组:S600、MP99-1、MC441、ARP065;
  白色菌株组:As2796、02、8213、As4607。
  1.1.2SCAR标记验证菌株
  SCAR标记验证菌株共48株(表1)。
  1.2方法
  1.2.1菌丝体培养
  菌种接入常规PDA斜面培养基(200 g马铃薯,20 g葡萄糖,20 g琼脂,1000 mL水),24 ℃培养21 d。
  1.2.2总DNA提取
  按文献[4]进行。
  1.2.3RAPD扩增
  按文献[5]进行。
  1.2.4RAPD产物克隆
  将目的条带用手术刀切出,根据美国Promega公司生产的胶回收试剂盒(Gel and PCR Clean-up System)回收,按照试剂盒说明操作,将回收片段与pGEM-T载体相连接转化E. coli DH5a,涂平板(含50 μg/mL氨苄青霉素),蓝白斑筛选。
  1.2.5测序及SCAR标记引物合成
  1.2.6SCAR标记引物PCR扩增
  总体积20 uL扩增体系:菌株基因组总DNA 30 ng,引物130 ng,引物230 ng,dNTPs 0.1 mmol/L,MgCl2 2.5 mmol/L,Taq DNA聚合酶 1 U,1×PCR缓冲液。扩增条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,扩增35个循环;72 ℃延伸10 min。扩增产物20 μL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。核酸染料Gene Finder染色并使用BIO-V 蓝盾621拍照。
  蔡志欣,等:双孢蘑菇颜色基因分子标记的初步筛选
  2 结果与分析
  2.1RAPD扩增与特异条带
  以8个引物筛选菌株为一组,从500个的RAPD随机引物中筛选出S33、S438、 S485 3个引物,这些引物在棕色菌株组能扩增出4个特异条带(大小300~2000 bp)(图1)。
  2.2SCAR标记验证
  将图1中箭头标示的4个特异扩增片段回收,克隆测序,依次命名为S1~S4,将合成的4对SCAR标记引物对48个菌株进行验证,结果表明,仅SCAR41200在24个棕色菌株的22个中能扩增出特异条带,而所有白色菌株中都没有此条带(图2),表明该标记与棕色菌株的棕色基因相关。
  3 讨论
  在双孢蘑菇的辅助杂交育种上,与性状相关的SCAR标记可以直接运用于菌株特性预测和遗传筛选。双孢蘑菇重要性状的分子标记如产质量[6-7]、性亲和[8]、丛生[9]、耐热[10]及退化[11]等都已开展了研究,但真正应用到育种中的标记很少,其中耐热性状标记片段已成功用于转基因育种[12]。在双孢蘑菇子实体颜色性状及相关基因和分子标记上,先前学者也开展了一些研究工作。CALLAC等[13]研究发现,在子实体颜色性状中,白色为隐性性状并受PPC1(pilei-pellis color 1)基因单一位点控制,研究还发现PPC1位点与乙醇脱氢酶(ADH)基因位点紧密连锁,并提出PPC1位点位于中心粒与ADH位点之间的观点。MOQUET等[14]通过数量性状座位(quantitative trait locus, QTL)定位的方法研究了双孢蘑菇褐斑病的抗病性状,连锁分析发现,抗病性状与PPC1棕色等位基因明显连锁,并推测PPC1基因本身可能就是抗性相关基因。LOFTUS等[15]找到了一个与双孢蘑菇子实体颜色白色性状连锁的RAPD标记A161700,并转化成SCAR标记L43,但该标记的有效性需与限制性片段长度多态性(restriction fragment langth polymorphism,RFLP)相结合,加大了应用的繁琐度,并且在部分菌株中出现标记与性状分离的情况。   本研究通过几百个RAPD随机引物的筛选,获得了与子实体颜色棕色等位基因相关的分子标记SCAR41200,全模板验证表明该标记与子实体棕色性状紧密连锁。下一步笔者将对该标记在杂交后代中的分离情况进行验证,该标记有望作为杂交育种中子实体棕色性状的定向筛选标记。
  参考文献
  [1]王泽生,廖?;?,陈美元. 我国双孢蘑菇育种研究与产业发展[J].食用菌学报,2010(增刊):19-20.
  [2] 陈美元,廖?;?,王波,等. 中国野生蘑菇属90个菌株遗传多样性的DNA指纹分析[J]. 食用菌学报, 2009, 16(1):11-20.
  [3] 章小寅,刘鹏虎,邓优锦,等.基于草菇基因组结构变异构建的SCAR标记遗传连锁图[G]//国家食用菌产业技术体系.国家食用菌产业技术体系第一届产业技术交流会论文汇编,南宁,2011:37-40.
  [4] 陈美元,廖?;?,李洪荣,等. 双孢蘑菇栽培菌株遗传多样性的DNA指纹分析[J]. 中国农学通报, 2009, 25(4):149-156.
  [5] 陈美元,廖?;?,王泽生.双孢蘑菇三种类型菌株的RAPD扩增研究[J].食用菌学报,1998, 5(4):6-10.
  [6] 宋思扬,曾伟,陈融,等. 一个与双孢蘑菇子实体品质相关的DNA片段的克隆[J]. 食用菌学报, 2000, 7(3):11-15.
  [7] FOULONQNE-ORIOL M, RODIER A, ROUSSEAU T, et al. Quantitative trait locus mapping of yield-related components and oligogenic control of the cap color of the button mushroom, Agaricus bisporus[J]. Appl Environ Microbiol, 2012, 78(7):2422-2434.
  [8] 詹才新,凌霞芬,杨家林. 双孢蘑菇性亲和性相关分子标记的初步筛选[J]. 食用菌学报, 2002,9(4):1-8.
  [9] 陈美元,王泽生,廖?;?,等. 双孢蘑菇丛生变异的RAPD分析及差异片段的克隆[J]. 厦门大学学报(自然科学版), 2003, 42(5):657-660.
  [10] 陈美元. 双孢蘑菇耐热相关基因028-1的克隆与序列分析[J].福建轻纺, 2006, (9):1-5.
  [11] 陈美元,王泽生,李洪荣,等. 双孢蘑菇分解基质能力退化的DDRT-PCR分析[J]. 菌物学报, 2010, 29(5):707-712.
  [12] 陈美元,廖?;?,郭仲杰,等. 双孢蘑菇耐热相关基因的表达载体构建及转化研究[J]. 菌物学报, 2009, 28(6):797-801.
  [13] CALLAC P, MOQUET F, IMBERNON M, et al. Evidence for PPC1, a determinant of the pilei-pellis color of Agaricus bisporus fruitbodies[J]. Fungal Genet Biol, 1998, 23(2):181-188.
  [14] MOQUET F, DESMERGER C, MAMOUN M, et al. A quantitative trait locus of Agaricus bisporus resistance to Pseudomonas tolaasii is closely linked to natural cap color[J]. Fungal Genet Biol, 1999, 28(1):34-42.
  [15] LOFTUS M, BOUCHTI-KING L, ROBLES C. Use of a SCAR maker for cap color in Agaricus bisporus breeding programs[M]//VAN GRIENSVEN.Science and Cultivation of Edible Fungi. Rotterdam: Balkema, 2000: 201-205.

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